肿瘤常见信号通路
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1、1 JAK-STAT信号通路1) JAK与STAT蛋白JAK-STAT信号通路是近年来发现的一条由细胞因子刺激的信号转导通路,参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等许多重要的生物学过程。与其它信号通路相比,这条信号通路的传递过程相对简单,它主要由三个成分组成,即酪氨酸激酶相关受体、酪氨酸激酶JAK和转录因子STAT。(1) 酪氨酸激酶相关受体(tyrosine kinase associated receptor)许多细胞因子和生长因子通过JAK-STAT信号通路来传导信号,这包括白介素2?7(IL-2?7)、GM-CSF(粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子)、GH(生长激素)、EGF(表皮生长因
2、子)、PDGF (血小板衍生因子)以及IFN(干扰素)等等。这些细胞因子和生长因子在细胞膜上有相应的受体。这些受体的共同特点是受体本身不具有激酶活性,但胞内段具有酪氨酸激酶JAK的结合位点。受体与配体结合后,通过与之相结合的JAK的活化,来磷酸化各种靶蛋白的酪氨酸残基以实现信号从胞外到胞内的转递。(2) 酪氨酸激酶JAK(Janus kinase)很多酪氨酸激酶都是细胞膜受体,它们统称为酪氨酸激酶受体(receptortyrosine kinase, RTK),而JAK却是一类非跨膜型的酪氨酸激酶。JAK是英文Janus kinase的缩写,Janus在罗马神话中是掌管开始和终结的两面神。之所
3、以称为两面神激酶,是因为JAK既能磷酸化与其相结合的细胞因子受体,又能磷酸化多个含特定SH2结构域的信号分子。JAK蛋白家族共包括4个成员:JAK1、JAK2、JAK3以及Tyk2,它们在结构上有7个JAK同源结构域(JAK homology domain, JH),其中JH1结构域为激酶区、JH2结构域是“假”激酶区、JH6和JH7是受体结合区域。(3) 转录因子STAT(signal transducer and activator of transcription) STAT被称为“信号转导子和转录激活子”。顾名思义,STAT在信号转导和转录激活上发挥了关键性的作用。目前已发现STAT家
4、族的六个成员,即STAT1-STAT6。STAT蛋白在结构上可分为以下几个功能区段:N-端保守序列、DNA结合区、SH3结构域、SH2结构域及C-端的转录激活区。其中,序列上最保守和功能上最重要的区段是SH2结构域,它具有与酪氨酸激酶Src的SH2结构域完全相同的核心序列“GTFLLRFSS”。2) JAK-STAT信号通路与其它信号通路相比,JAK-STAT信号通路的传递过程相对简单。信号传递过程如下:细胞因子与相应的受体结合后引起受体分子的二聚化,这使得与受体偶联的JAK激酶相互接近并通过交互的酪氨酸磷酸化作用而活化。JAK激活后催化受体上的酪氨酸残基发生磷酸化修饰,继而这些磷酸化的酪氨酸
5、位点与周围的氨基酸序列形成“停泊位点”(docking site),同时含有SH2结构域的STAT蛋白被招募到这个“停泊位点”。最后,激酶JAK催化结合在受体上的STAT蛋白发生磷酸化修饰,活化的STAT蛋白以二聚体的形式进入细胞核内与靶基因结合,调控基因的转录。值得一提的是,一种JAK激酶可以参与多种细胞因子的信号转导过程,一种细胞因子的信号通路也可以激活多个JAK激酶,但细胞因子对激活的STAT分子却具有一定的选择性。例如IL-4激活STAT6,而IL-12却特异性激活STAT4。2 p53信号1) p53基因的发现p53基因是迄今发现与肿瘤相关性最高的基因。1979年,Lane和Craw
6、ford在感染了SV40的小鼠细胞内分离获得一个与SV40大T抗原相互作用的蛋白,因其分子量为53 kDa,故而取名为p53(人的基因称为TP53)3。起初,p53被误认为是癌基因,直到上个世纪90年代,人们才认识到引起肿瘤形成或细胞癌变的p53蛋白是p53基因的突变产物。野生型p53基因是一种重要的抑癌基因,它是细胞生长周期中的负调节因子,在细胞周期调控、DNA损伤修复、细胞分化、凋亡和衰老等许多过程中发挥了重要的生物学功能,因而被誉为“细胞卫士”。随着研究的深入,人、猴、鸡、大鼠、非洲爪蟾和斑马鱼等多种模式动物的p53基因也相继被克隆。其中,人类TP53基因定位于染色体17P13.1,小鼠
7、p53基因被定位在11号染色体上,并在14号染色体上发现无功能的假基因。在这些进化程度迥异的动物中,它们的p53基因结构却异常保守,基因全长16-20kb,都由11个外显子和10个内含子组成。其中第1个外显子不编码结构域,外显子2、4、5、7、8则分别编码5个进化上高度保守的结构域,转录形成约2.5 kb的mRNA。之后,在基因同源性的基础上又陆续发现了p53家族的其它成员,分别是p73和p63,它们也因各自的分子量而得名,具有和p53相似的结构和功能。2) p53信号通路p53基因受多种信号因子的调控。例如:当细胞中的DNA损伤或细胞增殖异常时,p53基因被激活,导致细胞周期停滞并启动DNA
8、修复机制,使损伤的DNA得以修复。然而,当DNA损伤过度而无法被修复时,作为转录因子的p53还可进一步激活下游促凋亡基因的转录,诱导细胞凋亡并杀死有DNA损伤的细胞。不然,这些DNA损伤的细胞就可能逐渐脱离正常的调控,有可能最终形成肿瘤。虽然正常状态下p53的mRNA水平很高,而且有大量蛋白质合成,但p53蛋白容易降解,所以正常细胞内p53蛋白水平很低。蛋白的泛素化(ubiquitination)修饰是细胞内蛋白代谢过程中的最普通的降解方式,p53蛋白的降解也是通过泛素化来实现的。MDM2是一种特异性针对p53的泛素化E3连接酶,它可直接与p53蛋白结合来促进p53蛋白的泛素化降解,并在细胞内
9、p53蛋白动态平衡中发挥关键的作用。MDM2本身也可被p53蛋白激活,因此MDM2是p53通路中重要的负反馈调节因子(negative feedback regulator)。3) p53与肿瘤p53基因敲除小鼠虽然可以产生后代,但其生长发育过程中会出现高频率的自发性肿瘤,这提示p53蛋白与肿瘤之间存在密切的关系。事实上,目前TP53基因是与人类肿瘤的相关性最高的基因,与50%以上的人类恶性肿瘤有关,而且现正已在超过51种人类肿瘤病例中发现TP53基因的异常表达和功能失活。TP53基因突变是其功能失活的主要原因,至今已发现400多种TP53基因突变类型,其中147种与胃肠道肿瘤有关,而最常见的
10、突变方式是点突变。通过分析大量肿瘤病例中的TP53突变位点,证实肿瘤中95.1%的p53点突变位点发生在高度保守的DNA结合区,尤以第175、245、248、249、273和282位点的突变率最高。此外,某些点突变改变了p53的空间构象,影响了p53蛋白与MDM2和p300等蛋白的相互作用。另一些点突变发生在p53的核定位信号区,使p53无法进入细胞核发挥转录激活的功能。不同肿瘤的TP53基因突变位点并不一致,例如:结肠癌中G:CA:T转换占到79%;在乳腺癌中,GT颠换占到1/4,而这种突变在结肠癌十分少见;淋巴瘤和白血病的TP53基因突变方式与结肠癌相似;在肺癌中G:CT:A突变最普遍,而
11、食道癌中发生GT颠换的频率很高。目前看来,在肿瘤形成的复杂网络和调控体系中,p53是最主要的因素。有人认为p53是很好的肿瘤诊断标志物,可以作为癌症早期诊断的重要指标。认识到p53基因的重要作用后,全世界数以千计的分子生物学家正在抛开原来的课题转而研究p53,希望以此作为攻克癌症的突破口。科学家相信,利用p53基因发现并治疗癌症的前景非常广阔。除了基因治疗,研究人员正在筛选可以影响p53基因上下游调控的小分子化合物。罗氏制药公司开发的一种名为nutlins的小分子化合物,能够干扰p53和MDM2之间的调控关系,有望成为一种有效的抗癌药物。3 NF-B信号1975年,E. A. Carswell
12、和L. J. Old等人发现已接种卡介苗的小鼠注射脂多糖后,小鼠血清中产生了一种可引起动物肿瘤组织出血坏死的物质,该物质对体外培养的多种肿瘤细胞株都具有细胞杀伤作用,于是他们将这种物质命名为肿瘤坏死因子(tumour necrosis factor, TNF)。TNF是迄今发现的抗肿瘤效果最强的细胞因子。1984年起,欧美国家就开始把TNF的基因工程产品应用到癌症临床治疗中,并一度取得轰动的成果,然而最终由于毒副作用严重而被迫终止。九十年代末以来,随着基础研究的深入和基因工程技术的发展,科学家研制出一些高效、低毒的TNF变构体,从而重新确立了TNF在抗肿瘤中的重要地位,掀开了TNF在肿瘤研究和
13、治疗中的新篇章。1) TNF简介TNF是一种糖蛋白,它以两种形式存在:TNF-a和TNF-b。TNF-a由单核细胞和巨噬细胞产生,它可引起肿瘤组织出血坏死,而脂多糖(Lipopolysaccharides, LPS)是较强的刺激剂。TNF-b是一种淋巴因子,又称淋巴毒素(lymphotoxin, LT)。抗原或丝裂原均可刺激T淋巴细胞分泌TNF-b,具有肿瘤杀伤及免疫调节功能。 人的TNF-a基因长2.76 kb,由4个外显子和3个内含子组成,定位在第六号染色体上。人TNF-a前体由233个氨基酸组成,含有76个氨基酸残基的信号肽,切除信号肽后形成157个氨基酸的成熟型非糖基化的TNF-a。通
14、过基因工程方法改造后的TNF-a具有更好的生物学活性和抗肿瘤效果。2) TNF与NF-kB信号通路TNF-a与TNF-b分子结构相似,所发挥的生物学效应相近。胞外因子TNF-以三聚体形式发挥信号转导功能,与TNF受体(TNF receptor, TNFR)结合引起受体多聚化,这种多聚化使得TNF受体与细胞质中TRADD分子发生相互作用。TRADD招募相应蛋白后介导两条转导通路:一条是通过TRAF2和RIP分子诱导NF-B的活化,参与抗凋亡;另一条是通过FADD分子导致细胞凋亡。TNFR只有在蛋白合成受阻的情况下才会诱导凋亡,下面我们将着重介绍由TNF激活的NF-kB信号通路。NF-kB(nuc
15、lear factor-kappa B)是1986年从B淋巴细胞的细胞核抽提物中找到的转录因子,它能与免疫球蛋白kappa轻链基因的增强子B序列GGGACTTTCC特异性结合,促进轻链基因表达,故而得名。它是真核细胞转录因子Rel家族成员之一,广泛存在于各种哺乳动物细胞中。迄今为止,在哺乳动物细胞内共发现5种NF-kB/Rel家族成员,它们分别是RelA(即p65)、RelB、C-Rel、p50/NF-kB1(即p50/RelA)和p52/NF-kB2。这些成员均有一个约300个氨基酸的Rel同源结构域(Rel homology domain, RHD)。这个高度保守的结构域介导Rel蛋白形成
16、同源或异源二聚体,该结构域也是NF-kB与靶基因DNA序列的特异性结合区域。 细胞内NF-kB的活化过程受到精细调控。通常情况下,在细胞质中的NF-kB处于失活状态,与抑制蛋白IkB(inhibitory protein of NF-kB)结合成三聚体复合物。当出现TNF-a信号、炎症因子以及LPS、紫外线等外界刺激时,细胞因子与细胞膜表面的TNF受体结合后,TNF受体发生多聚化并与细胞质中TRADD分子发生相互作用。TRADD招募TRAF(TNFR-associated factor)和激酶RIP(receptor interacting protein),由RIP将信号传递给IKK(IkB
17、 kinase)。在NF-kB信号通路中IKK扮演了非常重要的角色,尽管上游信号路径的不同,但是最终都汇集到IKK。IKK由a、b和g三个亚基组成,作为激酶的IKK能使IkB的a亚基的Ser32和Ser36残基和b亚基的Ser19和Ser23残基磷酸化。IkB随即从p50/p65/IkB异源三聚体中解离出来,经泛素化修饰后通过蛋白酶体降解。于是,受到IkB抑制的NF-kB得以暴露其核定位序列(nuclear localization signals, NLS),迅速从细胞质进入细胞核内,与核内DNA上的特异序列相结合,从而启动或增强相关基因的转录。3) NF-kB信号通路与癌症NF-kB具有明
18、显的抑制细胞凋亡的功能,与肿瘤的发生、生长和转移等多个过程密切相关。在人类肿瘤尤其是淋巴系统的恶性肿瘤中,常可发现NF-kB家族基因的突变。NF-kB家族与癌症相关性的第一个线索是c-Rel基因的发现,它是禽类逆转录病毒癌基因v-Rel在细胞内的同源基因。该病毒在鸡体中造成多种造血细胞恶性转化,引起淋巴癌的发生。由于NF-kB的下游基因包括CyclinD1和c-Myc,因此NF-kB的持续激活会刺激细胞生长,导致细胞增殖失控。NF-kB在很多癌细胞中表达异常,如在75的乳腺癌样品中NF-kB2的表达比邻近的正常组织高很多倍。肿瘤细胞迁移并浸润到周围组织是肿瘤扩散和转移的前提条件。NF-kB对肿
19、瘤转移具有明显的促进作用,它能促进肿瘤转移相关基因ICAM-1、VCAM-1、MMP-9等的表达。NF-kB还能诱导血管内皮生长因子VEGF的表达,促进血管形成。此外,NF-kB还能通过调节COX2等基因的表达来促进肿瘤生长。NF-kB与肿瘤治疗息息相关。IFN-a、IFN-b、TNF-a、IL-2、G-CSF、GM-CSF和EPO是迄今为止被批准用于临床肿瘤治疗的几种细胞因子,其中前6种生长因子已被证实与NF-kB的信号通路有关。目前,国内外主要以NF-kB为靶点,使用抗氧化剂抑制NF-kB活性以及针对p65和p50设计小分子干扰RNA(siRNA)抑制NF-kB合成等方法作为癌症的治疗策略
20、,而且在动物实验及细胞培养中取得不同程度的疗效,但是离临床应用还有很大距离。由于TNF-a具有很好的抗肿瘤作用和多种免疫调节功能,许多国家开展了用TNF治疗癌症的临床研究。动物实验和临床实验均表明,TNF-a对某些肿瘤具有明显的抑制作用,但是由于不能很好地区分癌细胞和正常细胞,使用TNF-a后副作用较大,这为其大规模临床应用造成困难。应用基因工程改造得到低毒高效的TNF-a变构体,对某些肿瘤的治疗效果尤佳。将TNF-a与其它具有肿瘤抑制作用的细胞因子,如IL-2、IFN-g等联合使用,既可减少用药量、降低毒副作用,又可提高疗效,因而有望更快地大量应用于临床。4 Ras、PI(3)K和mTOR信
21、号1) 控制肿瘤生长的Ras、PI(3)K和mTOR信号随着人类基因组测序的完成,目前已发现了几百种蛋白激酶。根据它们结构上的相似性,这些激酶可分为多个蛋白家族,在细胞的增殖、生长、分化和凋亡等过程中发挥重要的生物学功能。Ras、PI(3)K和mTOR就是一类与细胞增殖紧密相关的蛋白激酶。真核细胞的正常生长受到周围环境所提供的养分的限制。Ras和PI(3)K信号通过调控下游分子mTOR,在调控细胞生长方面起着关键作用。在绝大多数的人肿瘤细胞中,Ras和PI(3)K信号通路中的关键调控因子都发生了明显的突变。究其原因,人们发现这条信号通路如果发生突变,就会导致细胞的存活和生长不再受到养分等环境条
22、件的限制,进而诱导细胞癌变。Ras、PI(3)K和mTOR是目前研究得最为清楚的信号通路之一。下面,我们将简单地介绍一下这条信号通路中的几个关键组分:(1) PI(3)K是英文phosphatidylinositol-3-kinase(磷脂酰肌醇-3-激酶)的缩写。它是一个包括许多脂质激酶的家族,由一个调节亚基(p85)和一个催化亚基(p110)组成。当配体与膜受体结合后,受体激活p85并招募p110,进而催化膜内表面的PIP2(phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate)生成PI3P(phosphatidylinositol 3-phosphate)。PI3
23、P作为第二信使,进一步激活AKT和PDK1(phosphoinositide-dependent kinase 1)。(2) AKT又称作PKB(protein kinase B),是PI3K重要的下游分子,包括至少3种形式,分别为AKT1、AKT2和AKT3。它们对于调控细胞的生长、增殖、存活以及糖代谢都起着十分重要的作用。(3) mTOR(mammalian target of rapamycin)是一类丝/苏氨酸激酶。1991年,人们在酵母中发现了雷帕霉素(rapamycin)的作用靶点,取名为TOR。与酵母相比,哺乳动物的TOR蛋白在进化和功能上高度保守,也就相应地称为mTOR。mTO
24、R蛋白的C末端具有激酶活性,它是细胞生长和增殖的关键调节分子,可接收生长因子、营养、能量等多种信号,并通过PI3K/AKT或Ras/ERK信号通路来发挥作用,而对mTOR信号通路的抑制可以使细胞停滞在G1期而触发细胞凋亡。 简单地说,当EGF、胰岛素等生长因子结合到细胞膜表面的酪氨酸激酶受体(receptor tyrosine kinase, RTK)后,RTK通过其酪氨酸激酶活性分别激活两个关键的信号转导分子:小G蛋白Ras和激酶PI(3)K,再由Ras和PI(3)K共同激活下游关键分子mTOR。激活后的mTOR蛋白促使底物S6K(S6 kinase)和4EBP1(4E binding pr
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